Duebelstrengeg RNA (dsRNA) ELISA KIT

Dëse Kit ass en Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kupplung mam Biotin-Streptavidin System, fir quantitativ Miessung vun dsRNA mat Längt iwwer 60 Basepaar (bp), onofhängeg vun der Sequenz.D'Plack gouf virbeschichtet mat Anti-dsRNA Antikörper.dsRNA präsent an der Probe gëtt bäigefüügt a bindt un Antikörper, déi op de Brunnen beschichtet sinn.An dann gëtt biotinyléiert Anti-dsRNA Antikörper bäigefüügt a bindt un dsRNA an der Probe.No der Wäschung gëtt HRP-Streptavidin bäigefüügt a bindt sech un de biotinyléierten Anti-dsRNA Antikörper.No der Inkubatioun gëtt ongebonnen HRP-Streptavidin ewechgewäsch.Duerno gëtt TMB Substratléisung bäigefüügt a vun HRP katalyséiert fir e bloe Faarfprodukt ze produzéieren dat a giel geännert huet nodeems se sauer Stopléisung bäigefüügt huet.D'Dicht vu Giel ass proportional zum Zilbetrag vun der dsRNA op der Plack ageholl.D'Absorptioun gëtt bei 450 nm gemooss.

Applikatioun

Dëse Kit ass fir quantitativ Miessung vu Reschter dsRNA.

Kit Komponente

Stockage a Stabilitéit

1. Fir onbenotzt Kit: De ganze Kit konnt bei 2 ~ 8 ℃ am Regal Liewen gespäichert ginn.Staark Liicht soll fir Lagerstabilitéit vermeit ginn.

2. Fir gebrauchte Kit: Wann d'Mikroplack opgemaach ass, deckt w.e.g. onbenotzt Brunnen mat Plack-Sealer a gitt zréck an d'Foliebeutel, déi den Trocknungspack enthält, d'Zip-Versiegelung vum Foliebeutel a gitt zréck op 2 ~ 8 ℃ sou séier wéi méiglech nom Gebrauch.Aner Reagenz solle sou séier wéi méiglech nom Gebrauch op 2 ~ 8 ℃ zréckgesat ginn.

Material erfuerderlech awer net geliwwert

1. Microplate Lieser mat 450 ± 10nm Filter (besser wann kann op 450 an 650 nm Wellelängt erkennen).

2. Microplate Shaker.

3. RNase-gratis Tipps an Zentrifuge Réier.

Operatioun Flowchart

Ier Dir ufänkt

1. Bréngt all Kitkomponenten a Proben op Raumtemperatur (18-25℃) virum Gebrauch.Wann de Kit net an enger Zäit benotzt gëtt, huelt w.e.g. nëmmen Sträifen a Reagenser fir den aktuellen Experiment eraus, a loosst déi verbleiwen Sträifen a Reagenzen an erfuerderlechen Zoustand.

2. Wäschbuffer: verdünnt 40mL vun 20 × konzentréierten Wäschbuffer mat 760mL vun deioniséierter oder destilléiertem Waasser fir 800mL vun 1 × Wäschbuffer ze preparéieren.

3. Standard: kuerz spin oder centrifuge der Stock Léisung virum Gebrauch.D'Konzentratioun vu véier geliwwert Standarden ass 5ng / μL.Fir UTP an pUTP dsRNA Standarden, verdënnt w.e.g. d'Stockléisung op 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg / μL mat STE Puffer fir d'Standardkurve ze zéien.Fir N1-Me-pUTP dsRNA Standarden, verdënnt w.e.g. d'Stockléisung op 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg /μL mat STE Puffer fir d'Standardkurve ze zéien.Fir 5-OMe-UTP dsRNA Standard, verdënnt w.e.g. d'Stockléisung op 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg /μL mat STE Puffer fir d'Standardkurve ze zéien.Mir recommandéieren d'Standarden ze verdünnen wéi folgend Charts:

4. Biotinyléiert Detektiounsantikörper an HRP-Streptavidin-Aarbechtsléisung: kuerz virum Gebrauch dréinen oder centrifugéieren d'Stammléisung.Verdünnt se op d'Aarbechtskonzentratioun mat Verdünnungsbuffer.

5. TMB Substate: aspiréiert déi néideg Dosis vun der Léisung mat steriliséierte Spëtze a dumpt d'Residualléisung net erëm an d'Flasche.TMB Substate ass empfindlech op Liicht, setzt den TMB Substrat net fir eng laang Zäit aus.

Benotzt Protokoll

1. Bestëmmt d'Zuel vun de Sträifen déi fir den Assay néideg sinn.Setzt d'Streifen an de Frames fir ze benotzen.Rescht Plackesträifen, déi net an dësem Assay benotzt ginn, sollten an der Täsch mat Trocknungsmëttel ëmgepackt ginn.D'Täsch dicht zoumaachen fir d'Gefrierlagerung.

2. Fügt 100μL jiddereng vun Verdünnungen vu Standard, eidel a Proben an déi passend Wells.Deckt mat der Plackeverdichter.Inkubéiert fir 1 Stonn bei Raumtemperatur mat Schüttelen bei 500 U/min.D'Probe solle mat STE-Puffer verdünnt ginn op eng passend Konzentratioun fir eng präzis Assay.

3. Wäschschrëtt: Aspiréiert d'Léisung a wäscht mat 250μL Wäschbuffer op all Wuel a léisst et fir 30s stoen.Wäschbuffer komplett ofleeën andeems Dir d'Plack op absorbéierend Pabeier knipst.Ganz 4 Mol wäschen.

4. Fügt 100μL vun biotinyléierter Detektiounsantikörper Aarbechtsléisung an all Brunn.Deckt mat der Plackeverdichter.Inkubéiert fir 1 Stonn bei Raumtemperatur mat Schüttelen bei 500 U/min.

5. Widderhuelen wäschen Schrëtt.

6. Fügt 100μL vun HRP-Streptavidin Aarbechtsléisung an all Well.Deckt mat der Plackeverdichter.Inkubéiert fir 30min bei Raumtemperatur mat schüttelen bei 500rpm.

7. Widderhuelen wäschen Schrëtt erëm.

8. Fügt 100μL vun TMB Substratléisung an all Well.Deckt mat der Plackeverdichter.Incubate fir 30 min bei RT Protect from Light.D'Flëssegkeet gëtt blo duerch d'Zousatz vun der Substratléisung.

9. Fügt 50μL Stoppléisung an all Well.D'Flëssegkeet gëtt giel duerch d'Zousatz vun der Stop-Léisung.Fuert dann de Mikroplate Lieser a maacht direkt Miessung bei 450nm.

Berechnung vun Resultater

1. Duerchschnëtt déi duplizéiert Liesungen fir all Standard, Kontroll a Proben a subtrahéieren déi duerchschnëttlech Null Standard optesch Dicht.Konstruéiert eng Standardkurve mat Absorptioun op der vertikaler (Y) Achs an dsRNA Konzentratioun op der horizontaler (X) Achs.

2. Et ass recommandéiert d'Berechnung mat Computer-baséiert Curve-passend Software wéi Curve Expert 1.3 oder ELISA Calc an engem 5 oder 4 Parameter net-linear Fitmodell ze maachen.

Leeschtung

1. Sensibilitéit:

ënnescht Limite vun erkennen: ≤ 0.001pg/μL (fir UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (fir 5-OMe-UTP-dsRNA).

ënnescht Limite vun quantitation: 0,0156 pg / μL (fir UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg / μL (fir N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg / μL (fir 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Präzisioun: CV vun Intra-Assay ≤10%, CV vun Inter-Assay ≤10%

3. Erhuelung: 80% ~ 120%

4.Linearitéit: 0,0156-0,5 pg/μL (fir UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (fir N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (fir 5-OMe-UTP-dsRNA).

Iwwerleeungen

1. TMB Reaktiounstemperatur an Zäit ass kritesch, kontrolléiert se w.e.g. no der Instruktioun strikt.

2. Fir gutt Assay-Reproduzibilitéit a Sensibilitéit z'erreechen, ass d'korrekt Wäschung vun de Placke fir iwwerschësseg onreagéiert Reagenz ze entfernen ass essentiell.

3. All d'Reagenser solle virum Gebrauch grëndlech gemëscht ginn a Bumbles vermeiden während Probe oder Reagenz-Additioun.

4. Wann Kristalle sech am konzentréierten Wäschbuffer (20x) geformt hunn, waarm op 37 ℃ a mëschen sanft bis d'Kristalle komplett opgeléist sinn.

5. Vermeit Assay vu Proben déi Natriumazid (NaN3) enthalen, well et d'HRP Aktivitéit zerstéiere kann, wat zu enger Ënnerschätzung vun der Quantitéit vun dsRNA resultéiert.

6. Vermeiden RNase Kontaminatioun während assay.

7. De Standard / Probe, Detectiounsantikörper an SA-HRP kënnen och op RT gemaach ginn ouni ze schüttelen, awer dëst kann d'Erkennungsempfindlechkeet ëm eng Kéier erofgoen.Fir dëse Fall, recommandéiere mir UTP an pUTP dsRNA Standarden soll aus 2pg /μL verdënntem ginn, N1-Me-pUTP dsRNA Standarden soll aus 4pg /μL verdënntem ginn an 5-OMe-UTP dsRNA Standard soll aus 8pg /μL verdënntem ginn.Zousätzlech, incubate HRP-Streptavidin Aarbecht Léisung fir 60min bei Raumtemperatur.Benotzt kee Flask Shaker, well Flask Shaker kann zu engem ongenau Resultat féieren.

Typesch Resultat

1. Standard Curve Daten

2. Standard Kurve Berechnung

3. Liner Detektiounsberäich: 0,0312- 1pg / μL