mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase gouf vun engem rekombinante E. coli Stamm ofgeleet, deen d'Gen fir d'vaccinia mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase dréit.Dëst Enzym füügt eng Methylgrupp an der 2'-O Positioun vum éischten Nukleotid nieft der Kapstruktur um 5'Enn vun der RNA derbäi. -0) resultéiert an enger Cap- 1 Struktur.
D'Cap1 Struktur kann d'Iwwersetzungseffizienz erhéijen, den Ausdrock vu mRNA an Transfektiouns- a Mikroinjektiounsexperimenter verbesseren. Dëst Enzym erfuerdert speziell RNA mat engem m7GpppN-Cap als Substrat.Et kann net RNA mat pN, ppN, pppN oder GpppN um 5' Enn benotzen.Capped RNA ka virbereet ginn iwwer in vitro Transkriptioun mat Cap Analog oder duerch enzymatesch Capping mam Vaccinia Capping Enzyme.
Komponenten
mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)
10 × Capping Reaktioun Buffer
Stockage
-25 ～- 15 ℃ fir Lagerung (Vermeiden widderholl Afréiere-Thaw-Zyklen)
Stockage Puffer
20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1% Triton X-100, 50% Glycerol.
Eenheet Definitioun
Eng Eenheet ass definéiert wéi d'Quantitéit un Enzym erfuerderlech ass fir 10 pmol vun 80 nt capped RNA Transkript an 1 Stonn bei 37 ° C ze methyléieren.
Qualitéitskontroll Assays
Exonuklease: 50U vun mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase mat 1μg λ-Hind III digest DNA bei 37 ℃ fir 16 Stonnen gëtt keng Degradatioun wéi vun agarose gel electrophoresis bestëmmt.
Endonuklease: 50 U vun mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase mat 1 μg λDNA bei 37 ℃ fir 16 Stonnen gëtt keng Degradatioun wéi bestëmmt duerch Agarosegel Elektrophorese.
Nickase: 50U vun mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase mat 1μg pBR322 bei 37 ℃ fir 16 Stonnen gëtt keng Degradatioun wéi vun Agarose Gel electrophoresis bestëmmt.
RNase: 50U vun mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase mat 1.6μg MS2 RNA fir 4 Stonnen bei 37 ℃ gëtt keng Degradatioun wéi vun Agarose Gel electrophoresis bestëmmt.
E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase gëtt op d'Präsenz vunE. coli genomesch DNA benotzt TaqMan qPCR mat Primer spezifesch fir denE. coli 16S rRNA Locus.DéiE. coli genomesch DNA Kontaminatioun ass =1E. coli genom.
Bakteriell Endotoxin: LAL-Test, laut Chinesesch Pharmacopoeia IV 2020 Editioun, Gellimit Testmethod, allgemeng Regel (1143).Bakteriell Endotoxin Inhalt soll = 10 EU / mg sinn.
Reaktioun System a Konditiounen
1. Kombinéiert eng adequat Betrag vu Capped RNA an RNase-gratis H2O an engem 1,5 mL Mikrofuge-Röhre bis zu engem finalen Volume vun 16,0 μL.
2. Hëtzt op 65 ℃ fir 5 Minutten gefollegt vun engem Äis-Bad fir 5 Minutten.
3. Füügt déi folgend Komponenten an der spezifizéierter Uerdnung (fir Methylatioun vu Capped RNA
manner wéi 10
| Komponent | Volumen |
| Denaturéiert capped RNA | 16 μl |
| 10X Capping Reaction Buffer* | 2 μl |
| SAM (4 mM) | 1 μl |
| mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50 U/μL) | 1 μl |
| ddH2O | Zu 20 μL |
*10 × Capping Reaction Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Inkubéiert bei 37 ℃ fir 1 Stonn (2 Stonnen Inkubatioun ass recommandéiert fir d'Zielfragment manner wéi 200 nt).
Uwendungen
Fir mRNA Ausdrock während Mikroinjektioun an Transfektiounsexperimenter ze verbesseren.
Notizen iwwer d'Benotzung
1. Virun der Reaktioun soll d'RNA gereinegt an an nukleasefräi Waasser opgeléist ginn, all d'Léisungen däerfen keng EDTA an Ionen enthalen.
2. Et ass recommandéiert d'Probe RNA bei 65 ℃ fir 5 min virun der Reaktioun ze erhëtzen fir d'sekundär Struktur um 5'Enn vum Transkript ze läschen.Et kéint op 10 min verlängert ginn fir komplex 5' -terminal Struktur.
