PNGase F
Peptid-N-Glycosidase F (PNGase F) ass déi effektivst enzymatesch Method fir bal all N-verbonne Oligosacchariden aus Glykoproteine ze entfernen.PNGase F ass eng Amidase, déi tëscht den banneschten GlcNAc an Asparaginreschter vun héije Mannose, Hybrid a komplexe Oligosacchariden aus N-verbonne Glykoproteine spalt.
Applikatioun
Dëst Enzym ass nëtzlech fir d'Entfernung vu Kuelenhydraterreschter aus Proteinen.
Virbereedung an Spezifizéierung
| Ausgesinn | Faarflos Flëssegkeet |
| Protein Rengheet | ≥95% (vum SDS-PAGE) |
| Aktivitéit | ≥500.000 U/mL |
| Exoglycosidase | Keng Aktivitéit konnt festgestallt ginn (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Eegeschaften
| EC Nummer | 3.5.1.52(Rekombinant aus Mikroorganismen) |
| Molekulare Gewiicht | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektresche Punkt | 8. 14 |
| Optimal pH | 7,0-8,0 |
| Optimal Temperatur | 65 °C |
| Spezifizitéit vum Substrat | Cleaving glycosidic Obligatiounen tëscht GlcNAc an asparagine Reschter Fig.1 |
| Unerkennung Siten | N-verbonne Glykanen ausser enthalen α1-3 Fukose Fig. 2 |
| Aktivatoren | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Späichertemperatur | -25 ~ -15 ℃ |
| Hëtzt Inaktivéierung | Eng 20 µL Reaktiounsmëschung mat 1 µL PNGase F gëtt duerch Inkubatioun bei 75 ° C fir 10 Minutten inaktivéiert. |
Fig. 1 Substrat Spezifizitéit vun PNGase F
Fig. 2 Unerkennung sëtzt vun PNGase F.
Wann déi intern GlcNAc Reschter mat α1-3 Fucose verbonne sinn, kann PNGase F net N-verbonne Oligosacchariden aus Glykoproteine spalten.Dës Ännerung ass heefeg a Planzen an e puer Insekt Glykoproteine.
CBestanddeeler
|
| Komponenten | Konzentratioun |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × Glykoprotein Denaturéierungsbuffer | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Eenheet Definitioun
Eng Eenheet (U) ass definéiert wéi d'Quantitéit un Enzym erfuerderlech ass fir > 95% vum Kohbhydrat aus 10 µg denaturéiert RNase B an 1 Stonn bei 37 ° C an engem Gesamtreaktiounsvolumen vun 10 µL ze entfernen.
Reaktioun Konditiounen
1.Opléise 1-20 µg Glycoprotein mat deioniséiertem Waasser, add 1 µl 10 × Glycoprotein Denaturing Buffer an H2O (wann néideg) fir en 10 µl Gesamtreaktiounsvolumen ze maachen.
2.Inkubéiert bei 100 ° C fir 10 min, killt et op Äis.
3.Füügt 2 μl 10 × GlycoBuffer 2, 2 μl 10% NP-40 a mëschen.
4.Füügt 1-2 μl PNGase F an H2O (wann néideg) fir en 20 µl Gesamtreaktiounsvolumen ze maachen a mëschen.
5.Inkubéiert Reaktioun bei 37 ° C fir 60 min.
6.Fir SDS-PAGE Analyse oder HPLC Analyse.
