RTL Reverse Transcriptase
RTL ëmgedréint Transkriptase ass eng RNA Template-ofhängeg DNA Polymerase déi d'3'→5' Exonuklease Aktivitéit feelt an RNase H Aktivitéit huet.Dëst Enzym kann RNA als Schabloun benotzen fir e komplementäre Strang vun DNA ze synthetiséieren, wat fir d'éischt-Sträng cDNA Synthese applizéiert ka ginn, besonnesch fir RT-LAMP (Loop-mediéiert isothermesch Amplifikatioun).Am Verglach mam RTL Reverse Transkriptase 1.0 ass d'Sensibilitéit wesentlech verbessert, d'thermesch Stabilitéit ass méi staark, an d'Reaktioun bei 65 ° C ass méi stabil.RTL ëmgedréint Transkriptase (Glycerolfräi) ka benotzt ginn fir lyophiliséierte Preparatiounen, lyophiliséierte RT-LAMP Reagenser etc.
Eenheet Definitioun
Eng Eenheet integréiert 1 nmol vun dTTP an sauer-precipitable Material an 20 Minutten bei 50 ° C mat Poly(A)•oligo(dT)25 als Schablounprimer.
Komponenten
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transkriptase (Glycerol-gratis) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 mll | 10 ml |
| 10 × HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Stockage Zoustand
Transport ënner 0 ° C a bei -25 ° C ~ -15 ° C gelagert ginn.
Qualitéitskontroll
- Rescht Aktivitéit vunEndonuklease:Eng 50 μL Reaktioun mat 1 μg λDNA a 15 Unitéiten vun RTL2.0 inkubéiert fir 16 Stonnen bei 37 ℃ weist datselwecht Muster wéi negativ Kontroll duerch Gelelektrophorese.
- Rescht Aktivitéit vunExonuklease:A 50 μL Reaktioun mat 1 μg vun Hind Ⅲ verdaut λDNA an 15 Unitéiten vun RTL2.0 fir 16 Stonnen bei 37 ℃ incubated weist selwecht Muster wéi negativ Kontroll vun gelies electrophoresis.
- Rescht Aktivitéit vunNickase:A 50 μL Reaktioun mat 1 μg vun supercoiled pBR322 an 15 Unitéiten vun RTL2.0 fir 4 Stonnen bei 37 ° C incubated weist selwecht Muster wéi negativ Kontroll vun gelies electrophoresis.
- Rescht Aktivitéit vunRNase:A 10 μL Reaktioun mat 0,48 μg vun MS2 RNA a 15 Unitéiten vun RTL2.0 fir 4 Stonnen bei 37 ° C incubated weist selwecht Muster wéi negativ Kontroll vun gelies electrophoresis.
- E. coli gDNA:Gemooss matE.colispezifesch HCD Detektiounskits, 15 Eenheeten vun RTL2.0 enthalen manner wéi 1E. coligenom.
Reaktioun Setup
cDNA Synthese Protokoll
| Komponenten | Volumen |
| Schabloun RNA a | fakultativ |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) oder Random Primer Mix (60uM) | 2 μl |
| dNTP Mix (10 mM jeweils) | 1 μl |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μl |
| Nuklease-gratis Waasser | Bis zu 20 μL |
Notizen:
1) Déi recommandéiert Dosis vum Total RNA ass 1ng ~ 1μg
2) D'recommandéiert Doséierung vun mRNA war 50ng ~ 100ng
Thermo-Vëlo Konditioune fir eng Routine Reaktioun:
| Temperatur (°C) | Zäit |
| 25 °Ca | 5 min |
| 55 °C | 10 Minuttenb |
| 80 °C | 10 Minutten |
Notizen:
1) Wann Random Primer Mix benotzt gëtt, eng Inkubatiounsschrëtt bei 25 ° C.
2) Wann Zilprimermix benotzt gëtt, en Inkubatiounsschrëtt bei 55 ° C fir 10 ~ 30mins.
RT-LAMP Protokoll
| Komponenten | Volumen | Finale Konzentratioun |
| Schabloun RNA | fakultativ | ≥10 Exemplare |
| dNTP Mix (10 mM) | 3,5 l | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primer (25×) | 1 μl | 1,6 μM |
| F3/B3 Primer (25×) | 1 μl | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μl | 0,4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U / Reaktioun |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U / Reaktioun |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μl | 8 U / Reaktioun |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10 × HC RTL Buffer (oder 10 × HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nuklease-gratis Waasser | Bis zu 25 μL | - |
Notizen:
1) Mix duerch Wirbelen a centrifugéiert kuerz fir ze sammelen.Konstant Temperatur Inkubatioun bei 65 ° C fir 1 Stonn.
2) Déi zwee Puffer sinn interoperabel an hunn déiselwecht Zesummesetzung.
Notizen
1.Dëst Produkt wäert e wäiss Feststoff bilden wann se bei -20 °C gelagert ginn.Huelt et vun -20°C eraus a setzt se fir ongeféier 10 Minutten op Äis.Nom Schmelzen kann et benotzt ginn andeems se schüttelen a vermëschen.
2.The cDNA Produit kéint bei -20 ° C oder -80 ° C gespäichert ginn oder direkt fir PCR Reaktioun benotzt ginn.
3.Fir RNase Kontaminatioun ze vermeiden, haalt w.e.g. d'Experimentalgebitt propper, a gitt propper Handschuesch a Masken während der Operatioun.
