Vaccinia Virus Capping Enzym

Vaccinia Virus Capping Enzym ass ofgeleet vun engem rekombinanten E. coli Stamm dréit d'Genen fir den Vaccinia Capping Enzym.Dësen eenzegen Enzym besteet aus zwou Ënnerunitéiten (D1 an D12) an huet dräi enzymatesch Aktivitéiten (RNA Triphosphatase a Guanylyltransferase vun der D1 Ënnerunitéit a Guanin Methyltransferase vun der D12 Ënnerunitéit).Vaccinia Virus Capping Enzyme ass effektiv fir d'Bildung vu Kapstruktur ze katalyséieren, déi speziell d'7-Methylguanylat Cap Struktur (m7Gppp, Cap 0) un de 5' Enn vun der RNA befestigen kann.Cap Struktur (Cap 0) spillt eng wichteg Roll bei der mRNA Stabiliséierung, Transport an Iwwersetzung an Eukaryoten.Capping RNA duerch enzymatesch Reaktioun ass eng effektiv an einfach Method déi d'Stabilitéit an d'Iwwersetzung vu RNA fir in vitro Transkriptioun, Transfektioun a Mikroinjektioun wesentlech verbesseren kann.

Komponenten

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10 × Capping Buffer

Stockage Konditiounen

-25～- 15℃ fir Lagerung (Vermeiden widderholl Afréiere-Thaw-Zyklen)

Stockage Puffer

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1% Triton X-100, 50% Glycerol.

Eenheet Definitioun

Eng Eenheet vum Vaccinia Virus Capping Enzyme ass definéiert wéi d'Quantitéit un Enzym erfuerderlech ass fir 10pmol GTP an en 80nt Transkript an 1 Stonn bei 37 °C ze integréieren.

Qualitéitskontroll

Exonuklease:10U vum Vaccinia Virus Capping Enzyme mat 1μg λ-Hind III Verdauungs-DNA bei 37 ℃ fir 16 Stonnen gëtt keng Degradatioun wéi bestëmmt duerch Agarosegel Elektrophorese.

Endonuklease:10U vum Vaccinia Virus Capping Enzyme mat 1μg λDNA bei 37 ℃ fir 16 Stonnen gëtt keng Degradatioun wéi bestëmmt duerch Agarose Gel Elektrophorese.

Nickase:10U vum Vaccinia Virus Capping Enzyme mat 1 μg pBR322 bei 37 ℃ fir 16 Stonnen gëtt keng Degradatioun wéi bestëmmt duerch Agarosegel Elektrophorese.

RNase:10U vum Vaccinia Virus Capping Enzyme mat 1.6μg MS2 RNA fir 4 Stonnen bei 37 ℃ gëtt keng Degradatioun wéi bestëmmt duerch Agarosegel Elektrophorese.

1.coli DNA:10U vum Vaccinia Virus Capping Enzyme gëtt gescannt fir d'Präsenz vun E. coli genomesch DNA mat TaqMan qPCR mat Primer spezifesch fir den E. coli 16S rRNA Locus.D'E. coli genomesch DNA Kontaminatioun ass ≤1 E. coli Genom.

2.Bakteriell Endotoxin: LAL-Test, laut Chinesesch Pharmacopoeia IV 2020 Editioun, Gellimit Testmethod, allgemeng Regel (1143).Bakteriell Endotoxin Inhalt soll ≤10 EU / mg sinn.

Reaktioun System a Konditiounen

1. Capping Protokoll (Reaktiounsvolumen: 20 μL)

Dës Prozedur ass applicabel fir d'Cappingreaktioun vun 10μg RNA (≥100 nt) an et kann no experimentellen Ufuerderungen opskaléiert ginn.

I) Kombinéiert 10μg RNA an Nuklease-gratis H2O an engem 1,5 ml Mikrofuge-Röhre bis zu engem finalen Volume vun 15,0 μL.*10×Capping Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Hëtzt bei 65 ℃ fir 5 Minutten gefollegt vun Äisbad fir 5 Minutten.

3) Füügt déi folgend Komponenten an der spezifizéierter Uerdnung

*10×Capping Buffer: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

4) Inkubéiert bei 37 ° C fir 30 Minutten, RNA ass elo capped a prett fir downstream Uwendungen.

2.5 ′ Terminal Etikettéierungsreaktioun (Reaktiounsvolumen: 20 μL)

Dëse Protokoll ass entwéckelt fir RNA mat engem 5' Triphosphat ze bezeechnen an et kann no Ufuerderunge skaléiert ginn.D'Effizienz vun der Labelinkorporatioun gëtt beaflosst vum molare Verhältnis vu RNA: GTP, souwéi vum GTP Inhalt an RNA Proben.

1) Kombinéiert entspriechend Betrag vun RNA an Nuklease-gratis H2O an engem 1,5 ml Mikrofuge-Röhre bis zum Schlussvolumen vun 14,0 µL.

2) Hëtzt bei 65 ℃ fir 5 Minutten gefollegt vun Äisbad fir 5 Minutten.

3) Füügt déi folgend Komponenten an der spezifizéierter Uerdnung derbäi.

** GTP MIX bezitt sech op GTP an eng kleng Zuel vu Markéierer.Fir d'Konzentratioun vu GTP, kucktop Note 3.

4) Inkubéiert bei 37 ° C fir 30 Minutten, RNA 5′ Enn ass elo markéiert a prett fir downstream

Uwendungen

1. Capping mRNA virun Iwwersetzung Assays / In vitro Iwwersetzung

2. Etikettéieren 5' Enn vun mRNA

Notizen iwwer d'Benotzung

1.D'Hëtzt vun der Léisung vu RNA virun der Inkubatioun mam Vaccinia Capping Enzyme läscht sekundär Struktur um 5'Enn vum Transkript.Verlängert Zäit op 60 Minutten fir Transkriptiounen mat bekannten héich strukturéierten 5'Enn.

2. RNA benotzt fir Kappreaktiounen soll virum Gebrauch gereinegt ginn an an nukleasefräi Waasser suspendéiert ginn.EDTA soll net präsent sinn an d'Léisung soll fräi vu Salzer sinn.

3. Fir d'Etikettéierung vum 5' Enn sollt d'total GTP Konzentratioun ongeféier 1-3 Mol d'molar Konzentratioun vu mRNA an der Reaktioun sinn.

4. De Volume vum Reaktiounssystem kann no der aktueller Skala erop oder erofgesat ginn.