M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase ass eng ëmgedréint Transkriptase kritt duerch Mutatiounsscreening vum M-MLV Gen vum Moloney murine Leukämie Virus Hierkonft an Ausdrock an E.coli.Den Enzym läscht d'RNase H Aktivitéit, huet méi héich Temperaturtoleranz, an ass gëeegent fir Héichtemperatur ëmgedréint Transkriptioun.Dofir ass et hëllefräich fir déi ongënschteg Auswierkunge vun der RNA héijen Niveau Struktur an net spezifesche Faktoren op cDNA Synthese ze eliminéieren, an huet méi héich Stabilitéit an ëmgedréint Transkriptiounssynthese Fäegkeet.Den Enzym huet méi héich Stabilitéit a Reverse Transkriptiounssynthesefäegkeet.
Komponenten
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (optional)
* 5 × First-Strand Buffer enthält keen dNTP, füügt w.e.g. dNTPs derbäi wann Dir de Reaktiounssystem virbereet
Recommandéiert Applikatioun
1.Ee-Schrëtt qRT-PCR.
2.RNA Virus Detektioun.
Stockage Zoustand
-20°C fir laangfristeg Lagerung, sollt virum Gebrauch gutt gemëscht ginn, evitéiert heefeg Afréiere-Thaw.
Eenheet Definitioun
Eng Eenheet integréiert 1 nmol dTTP an 10 Minutten bei 37 ° C mat Poly(A)•oligo(dT)25als Schabloun / Primer.
Qualitéitskontroll
1.SDS-PAGE elektrophoretesch Rengheet méi wéi 98%.
2.Amplifikatiounsempfindlechkeet, Batch-zu-Batch Kontroll, Stabilitéit.
3.Keng exogen Nuklease Aktivitéit, keng exogen Endonuklease oder Exonuklease Kontaminatioun
Reaktioun Setup fir Éischt Kette Reaktioun Léisung
1.Virbereedung vun der Reaktiounsmëschung
| Komponenten | Volumen |
| Oligo (dT)12-18 Primer oder Random Primera Oder Gene spezifesch Primerb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μl |
| Schabloun RNA | Total RNA ≤ 5μg;mRNA ≤ 1 μg |
| RNase-fräi dH2O | Zu 10 μL |
Notizen:a / b: Wielt w.e.g. verschidden Aarte vu Primer no Ären experimentellen Bedierfnesser.
2.Heizen op 65°C fir 5mins a killen séier op Äis fir 2mins.
3.Füügt déi folgend Komponenten un de uewe genannte System op e Gesamtvolumen vun 20μL a mëscht sanft:
| Komponenten | Volumen (μL) |
| 5 × Éischt-Strand Buffer | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase Inhibitor (40 U/μL) | 1 |
| RNase-fräi dH2O | Zu 20 μL |
4.Please Leeschtunge der Reaktioun no de folgende Konditiounen:
(1) Wann Random Primer benotzt gëtt, soll d'Reaktioun bei 25 ℃ fir 10mins duerchgefouert ginn, an dann bei 50 ℃ fir 30 ~ 60mins;
(2) Wann Oligo dT oder spezifesch Primer benotzt ginn, soll d'Reaktioun bei 50 ℃ fir 30 ~ 60mins duerchgefouert ginn.
5.Hëtzt op 95 ℃ fir 5mins fir Neoscript Reverse Transcriptase ze inaktivéieren an d'Reaktioun ofzeschléissen.
6.Reverse Transkriptiounsprodukter kënnen direkt an der PCR Reaktioun a Fluoreszenz quantitativer PCR Reaktioun benotzt ginn, oder bei -20 ℃ fir eng laang Zäit gelagert ginn.
PCR RAktioun:
1.Virbereedung vun der Reaktiounsmëschung
| Komponenten | Konzentratioun |
| 10 × PCR Buffer (dNTP fräi, Mg²+ fräi) | 1× |
| dNTPs (10 mM all dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Schablouna | ≤10% Éischt Kette Reaktioun Léisung (2 μL) |
| ddH2O | Zu 50 μL |
Notizen:a: Wann zevill éischt Kettenreaktiounsléisung dobäigesat gëtt, kann d'PCR-Reaktioun hemmt ginn.
2.PCR Reaktioun Prozedur
| Schrëtt | Temperatur | Zäit | Cyclen |
| Pre-Denaturatioun | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturatioun | 95 ℃ | 10-20 Sek | 30-40 |
| Annealing | 50-60 ℃ | 10-30 Sek | |
| Erweiderung | 72℃ | 10-60 Sek |
Notizen
1.Gëeegent fir ëmgedréint Transkriptiounstemperaturoptiméierung am Beräich vun 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Et huet besser Stabilitéit, ass gëeegent fir héich Temperatur ëmgedréint Transkriptioun amplification.Zousätzlech ass et favorabel fir effizient duerch komplex strukturell Regioune vu RNA ze passéieren.Och, etass gëeegent fir een-Schrëtt Multiplex Fluoreszenz quantitativ RT-PCR Detektioun.
3.Gutt Kompatibilitéit mat verschiddene PCR Amplifikatioun Enzyme an ass gëeegent fir héich Empfindlechkeet RT-PCR Reaktiounen.
4.Gëeegent fir héich Empfindlechkeet One-Schrëtt Fluoreszenz quantitativ RT-PCR Reaktioun, verbessert effektiv d'Detektiounsquote vu gerénger Konzentratioun vu Schabloune.
5.Gëeegent fir cDNA Bibliothéik Konstruktioun.
