Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG oder UDG) ass e rekombinante Klon vun E.coli mat engem Molekulargewiicht vu 25 kDa.Et katalyséiert d'Verëffentlechung vu fräiem Uracil aus uracil-enthaltende eenzegstrengegen an duebelstrengegen DNA, an ass inaktiv géint RNA, a ka benotzt ginn fir Kontaminatioun vu PCR Amplifikatiounsprodukter ze vermeiden.De Prinzip vun der Handlung baséiert op der Tatsaach datt wann dUTP duerch dTTP an der PCR Reaktioun ersat gëtt an e PCR Amplifikatiounsprodukt geformt gëtt deen dU Basen enthält, kann den Enzym selektiv d'glycosidesch Bindung vun U Basen an eenzegstrengeg an duebelstrengeg briechen. DNA an degradéiert de PCR Amplifikatiounsprodukt.
Recommandéiert Applikatioun
Kontaminatioun Präventioun Amplifikatioun
Stockage Zoustand
-20°C fir laangfristeg Lagerung, sollt virum Gebrauch gutt gemëscht ginn, evitéiert heefeg Afréiere-Thaw.
Stockage Puffer
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilisator, 50% Glycerol.
Eenheet Definitioun
D'Quantitéit un Enzym erfuerderlech fir 1 µg eenzegstrengeg DNA mat dU Basen an 1 Stonn bei 37 ° C ze degradéieren ass 1 Eenheet.
Qualitéitskontroll
1.SDS-PAGE elektrophoretesch Rengheet méi wéi 98%
2.Amplifikatioun Empfindlechkeet, Batch-zu-Batch Kontroll, Stabilitéit
3.Nodeems 1U UNG bei 50 ℃ fir 2mins behandelt gëtt, soll d'Schabloun mat U ënner 103 Exemplare komplett degradéiert ginn a kee Verstärkungsprodukt ka produzéiert ginn
4.Keng exogen Nuklease Aktivitéit
Uweisungen
| Komponenten | Volumen (μL) | Finale Konzentratioun |
| 10 × PCR Buffer (dNTP fräi, Mg²+fräi) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (dTTP ersetzen) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Schabloun | - | ＜1μg/Reaktioun |
| ddH₂O | Zu 50 | - |
Notiz: a: Wann fir qPCR / qRT-PCR benotzt gëtt, soll d'fluorescent Sonde an de Reaktiounssystem bäigefüügt ginn.Normalerweis kann eng final Primer Konzentratioun vun 0,2 μM gutt Resultater ginn;Wann d'Reaktiounsleistung schlecht ass, kann d'Primerkonzentratioun am Beräich vun 0,2-1 μM ugepasst ginn.Normalerweis gëtt d'Sondkonzentratioun am Beräich vun 0,1-0,3 μM optimiséiert.Konzentratiounsgradientexperimenter kënne gemaach ginn fir déi bescht Kombinatioun vu Primer a Sonde ze fannen.
Notizen
1.UNG Enzym kann benotzt ginn fir déi kontaminéiert dUTP Amplifikatiounsprodukter aus dem Reaktiounssystem virun der PCR Amplifikatiounsreaktioun ze läschen, dann fir falsch-positiv Resultater wéinst der Produktkontaminatioun ze vermeiden.
2.Déi optimal Temperatur fir UNG Enzym fir an der Anti-Kontaminatioun PCR Reaktioun ze benotzen ass allgemeng 50 ℃ fir 2mins;den Inaktivéierungskonditioun ass 95 ℃ fir 5mins.
3.Vermeiden heefeg Afréiere-Thaw, a setzt net op grouss Temperaturschwankungen aus.
4.Verschidde Genen, déi amplifizéiert ginn, hunn ënnerschiddlech Benotzungseffizienz vun dUTP a Empfindlechkeet fir UNG Enzym, dofir, wann d'Benotzung vum UNG System zu enger Ofsenkung vun der Detektiounsempfindlechkeet féiert, sollt de Reaktiounssystem ugepasst an optimiséiert ginn, wann Dir technesch Ënnerstëtzung braucht, kontaktéiert w.e.g. eis Firma.
