EndoFree Plasmid Maxi Kit
Dëse Kit ass gëeegent fir Extraktioun vu 150 - 300 ml bakteriell Léisung iwwer Nuecht kultivéiert, mat enger verbesserter SDS-alkalescher Lysismethod fir d'Bakterien ze lyséieren.De rau Extrakt gëtt selektiv mat engem eenzegaartegen Endotoxin Scavenger kombinéiert a getrennt duerch Zentrifugéierung fir Endotoxine ze entfernen.Dann bindt d'Silikagel Membran selektiv un d'Plasmid DNA an der Léisung ënner Bedéngungen vun héije Salz a nidderegen pH.Dëst ass gefollegt vun der Zousatz vu Wäschbuffer fir Gëftstoffer an aner bakteriell Komponenten ze entfernen.Schlussendlech gëtt e Low-Salz, High-PH Elutiounsbuffer benotzt fir pure Plasmid DNA aus der Silizium Matrix Membran ze elueren.D'Silikagel Membran beschäftegt eng speziell Adsorptiounsmembran, an den Adsorptiounsbetrag Ënnerscheed tëscht der Kolonn an der Kolonn ass ganz kleng an d'Wiederholbarkeet ass gutt.Phenol, Chloroform an aner gëfteg Reagenz sinn net erfuerderlech, a weder Ethanol Nidderschlag Schrëtt.Dëse Kit kann benotzt ginn fir séier 0,2 -1,5 mg pure High-Copy Plasmid DNA ze extrahieren, mat enger Extraktiounsquote vun 80% -90%.De Kit benotzt eng eenzegaarteg Prozessformel läscht Endotoxin, den Inhalt vun Endotoxin ass extrem niddereg an den Zelltransfektiounseffekt ass exzellent.Den extrahéierte Plasmid konnt direkt an Enzym Verdauung, PCR, in vitro Transkriptioun, Transformatioun, Sequenzéierung an aner molekulare Biologesch Experimenter benotzt ginn.
Stockage Konditiounen
RNaseA soll bei -30 ~ -15 ℃ gespäichert ginn a bei ≤0 ℃ transportéiert ginn.
Endotoxin Scavenger kann bei 2 ~ 8 ℃ fir ee Mount gespäichert ginn, bei -30 ~ -15 ℃ fir laangfristeg Lagerung gelagert ginna transportéiert bei ≤0 ℃.
Aner Komponente solle bei Raumtemperatur (15 ~ 25 ℃) gelagert ginn a bei Raumtemperatur transportéiert ginn.
Komponenten
| Komponenten | 10 RXNS |
| RNase A | 750 l |
| Buffer P1 | 75ml |
| Buffer P2 | 75ml |
| Buffer P4 | 75ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi Kolonnen (Jiddereen an engem 50ml Sammlung Tube) | 10 |
| Endotoxin-gratis Collection Tube | 2 x5 |
RNaseA:10 mg / ml, benotzt fir RNA ze läschen.
Buffer P1:bakterielle Suspensionbuffer, füügt RNaseA op de Buffer P1 virum éischte Gebrauch.
Buffer P2:bakterielle Lysisbuffer (enthält SDS / NaOH).
Buffer P4:neutraliséierend Puffer.
Endotoxin Scavenger:effektiv Endotoxin aus dem rau Plasmidextrakt ewechhuelen.
Buffer PW:wäschen Puffer, füügt de virgeschriwwene Volumen vun Ethanol virum éischte Gebrauch.
Buffer TB:elueringsbuffer.
FastPure DNA Maxi Kolonnen:Plasmid DNA Adsorptiounskolonnen.
Sammlung Tubes 50 ml:Filtrat Sammlung Tubes.
Endotoxin-gratis Sammlung Tube:Plasmid DNA Sammlung Tubes.
Preparéiert Material
Absolut Ethanol, Isopropanol, 50 ml Ronn-Ënner Zentrifuge Réier an 50 ml endotoxin-fräiZentrifuge Réier.
Uwendungen
Dëst Produkt ass gëeegent fir grouss-Skala Extraktioun vun Plasmiden aus 150 - 300 ml vun bakteriell Léisungiwwer Nuecht kultivéiert.
Experimenter Prozess
1. Huelt 150 - 200 ml (net méi wéi 300 ml) Bakterienléisung iwwer Nuecht kultivéiert an centrifugéiert umongeféier 11.000 U/min (12.000 × g) fir 1 – 2 min.Entlooss den Supernatant a sammelt Bakterien.
Δ Wann Dir méi wéi 50 ml bakteriell Léisung sammelt, kënnen d'Bakterien gesammelt ginn andeems bakteriell Léisung bäigefüügt ginn, Zentrifugéierung, Oflehnung vum Supernatant an aner Schrëtt am selwechte 50 ml Tube fir
e puer Mol.
2. Füügt 7,5 ml Buffer P1 (kuckt w.e.g. ob RNaseA zum Buffer P1 bäigefüügt gouf) an d'ZentrifugeRéier mat Bakterien a grëndlech duerch Wirbel oder Pipette vermëschen.
Δ Déi komplett Resuspensioun vu Bakterien an dësem Schrëtt ass kritesch fir nozeginn, an et sollte keng bakteriell Klumpen no der Resussioun sinn.Wann et bakteriell Klumpen sinn, déi net grëndlech gemëscht sinn, wäert et d'Lys beaflossen, wat zu enger gerénger Ausbezuelung a Rengheet resultéiert.Wann d'OD600 vun der bakterieller Léisung 0,65 ass, ass et recommandéiert datt 7,5 ml Buffer P1 benotzt gëtt wann Dir aus 150 ml bakterieller Léisung extrahéiert;wann OD600 0,75 ass, soll 8 ml vun Buffer P1 benotzt ginn an de Volume vun Bufferen P2 an P4 soll deementspriechend geännert ginn.Wann de Volume vun der bakterieller Léisung op 200 ml erhéicht gëtt, ass et recommandéiert d'Volume vun Bufferen P1, P2, an P4 proportional erhéicht ginn.
3. Füügt 7,5 ml Buffer P2 an d'bakteriell Suspension vum Schrëtt 2 a mëschen sanft erop an erof fir 6 - 8Mol an inkubéiert bei Raumtemperatur fir 4-5 min.
Δ Invertéiert sanft fir grëndlech ze vermëschen.Vortexing wäert d'genomesch DNA Fragmentatioun verursaachen, wat zu genomesche DNA Fragmenter am extrahéierten Plasmid resultéiert.Zu dëser Zäit gëtt d'Léisung viskos an transluzent, wat weist datt d'Bakterien komplett lyséiert goufen.D'Dauer däerf net méi wéi 5 min sinn fir d'Zerstéierung vun de Plasmiden ze vermeiden.Wann d'Léisung net kloer ass, kann et ze vill Bakterien ginnonvollstänneg Lysis, sou datt d'Quantitéit u Bakterien entspriechend reduzéiert ginn.
4. Füügt 7,5 ml Buffer P4 an d'bakteriell Suspension vum Schrëtt 3 an dréit direkt sanft 6 - 8 Mol ëm, fir datt d'Léisung de Buffer P2 komplett neutraliséiere kann.Zu dëser Zäit sollt wäiss flocculent Nidderschlag optrieden.Zentrifuge bei méi wéi ongeféier 11.000 rpm (12.000 × g) fir 10 - 15 min, suergfälteg den Supernatant an en neit 50 ml Ronn-ënnen Zentrifugeröhre (selwer virbereet) a vermeidenaspiréiert de schwiewende wäisse Nidderschlag.
Δ Buffer P4 derbäisetzen an direkt ëmdréinen fir gutt ze mëschen.Loosst d'Röhre stoen bis de wäisse Nidderschlag gläichméisseg duerch d'Léisung verdeelt gëtt fir d'Produktioun vu lokalen Nidderschlag ze verhënneren, déi d'Neutraliséierung beaflossen.Wann et keen eenheetleche wäisse flocculent Nidderschlag virun der Zentrifugatioun ass an de Supernatant no der Zentrifugéierung net kloer ass, kann de Röhre sinncentrifugéiert fir eng aner 5 min.
5. Füügt 0. 1 Mol de Volume (10% vum Supernatantvolumen, ongeféier 2,2 ml) Endotoxin Scavenger an den Supernatant vum Schrëtt 4 an ëmgedréint fir ze vermëschen.Setzt d'Léisung an engem Äisbad oder setzt an zerquetschtem Äis (oder Frigo Frigo) fir 5 min bis d'Léisung vun turbid op kloer an transparent ännert (oder nach ëmmer)liicht turbid), a heiansdo e puer Mol vermëschen.
Δ Nodeems den Endotoxin Scavenger un den Supernatant bäigefüügt ass, gëtt de Supernatant turbid awer deSupernatant soll kloer ginn (oder liicht turbid) no Ofkillung am Äisbad.
6. Nodeems de Supernatant bei Raumtemperatur (> 25 ℃) fir 10 - 15 min plazéiert ass, gëtt et turbid wéiseng Temperatur klëmmt op Raumtemperatur.Da soll de Supernatant ëmgedréint ginn fir ze vermëschen.
Δ Wann Raumtemperatur méi niddereg ass oder Dir wëllt Extraktiounszäit reduzéieren, kann de Supernatant an engem 37 ~ 42 ℃ Waasserbad fir 5 - 10 min inkubéiert ginn an de nächste Schrëtt kann nom Supernatant duerchgefouert ginngëtt turbid.
7. Zentrifuge de Supernatant bei ongeféier 11.000 rpm (12.000 × g) fir 10 min bei Raumtemperatur (Temperatur muss> 25 ℃ sinn) fir d'Phase ze trennen.Déi iewescht wässerlech Phase enthält d'DNA, während déi ënnescht blo Uelegphase Schicht Endotoxin an aner Gëftstoffer enthält.Transfert deDNA-haltege wässerlech Phase zu engem neie Rouer andéi ueleg Schicht entwerfen.
Δ D'Temperatur während der Zentrifugéierung muss iwwer 25 ℃ sinn, well effektiv Phase Trennung netgeschitt wann d'Temperatur ze niddreg ass.
Δ Wann d'Phasenrennung net effektiv ass, kann d'Zentrifugéierungstemperatur op 30 ℃ ugepasst ginn and'Zäit vun der Zentrifugéierung kann op 15 min erhéicht ginn.
Δ Saug net déi blo Ueleg Schicht well et Endotoxin an aner Gëftstoffer enthält.
Mechanismus
Resuspension Lysis Neutraliséierung
◇ Füügt 7,5 ml Buffer P1
◇ Füügt 7,5 ml Buffer P2
◇ Füügt 7,5 ml Buffer P4
Endotoxin Entfernung
◇ Füügt 0. 1 Mol de Supernatantvolumen vun Endotoxin Scavenger
Bindung a Wäsch
◇ Füügt 0,5 Mol de Volume vun Isopropanol
◇ Füügt 10 ml Buffer PW
◇ Füügt 10 ml Buffer PW
Elutioun
◇ Füügt 1 - 2 ml Buffer TB oder Endotoxin-fräi ddH2O
