Planz direkt PCR Kit
Cat No: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit ass gëeegent fir direkt Verstäerkung vu Planzblieder, Somen, asw., a ka fir High-Throughput-Screening vu Planzenproben benotzt ginn, déi keng Polysacchariden a Polyphenole enthalen.Déi direkt Amplifikatioun DNA-Polymerase baséiert op der geriichtter Evolutioun huet superior Toleranz fir PCR-Inhibitoren a Planzen.Mëttlerweil behält et déi héich Amplifikatiounsleistung, déi gëeegent ass fir d'Verstäerkung vun DNA Fragmenter bannent 5 kb.Den eenzegaartegen Lysis-Puffer A am Kit kann benotzt ginn fir frësch oder gefruer Planzgewebe ze lyséieren.Et ass einfach ze bedreiwen an d'Lysat kann als Schabloun fir Amplifikatioun benotzt ginn ouni Reinigung.De System enthält Schutzmëttelen déi et erlaben datt rau Proben effektiv verstäerkt ginn no widderholl Afréiere an Ofdehnung.2 × Plant Direct Master Mix brauch nëmme Primer a Schablounen ze addéieren fir d'Verstäerkungsreaktioun auszeféieren, doduerch d'Pipetéierungsoperatiounen ze reduzéieren an d'Erkennungsduerchgang an d'Reproduzibilitéit vun de Resultater ze verbesseren.
Komponenten
| Komponenten | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Plant Direct Master Mix | 1,25 ml | 4 × 1,25 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer A | 5ml vun | 20 ml |
| Plant Direct Lysis Buffer B* | 5ml vun | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B ass en optionalen Reagens, dee benotzt gëtt fir Plant Direct Lysis Buffer A ze neutraliséieren fir d'Späicherzäit vu Proben ze verlängeren.Et kann no der aktueller Situatioun benotzt ginn.
Stockage Konditiounen
2 × Plant Direct Master Mix, späicheren bei -30 ~ -15 ℃ a vermeit widderholl Gefrierung an Verdauung;Planz Direkt Lysis Buffer, späichere bei -30 ~ -15 ℃ oder 2 ~ 8 ℃.
Experimenter Prozess
Probe Veraarbechtung-Planz Leaf
Direkt Method:Et ass recommandéiert jonk Blieder ze benotzen.Benotzt e Lachpunch mat engem fixen Duerchmiesser vun 0,5 - 3 mm fir eng kleng an eenheetlech Samplea ze kréien, an dann direkt d'Probe an de PCR System addéieren (50 μl System ass recommandéiert).Notéiert, gitt sécher datt d'Probe an der PCR-Léisung ass an net géint d'Röhremauer.Wann direkt PCR benotzt gëtt fir laang Fragmenter a komplexe Proben ze verstäerken, kann e Probe mat engem méi klengen Duerchmiesser (0,5 - 1 mm) als Schabloun hëllefe fir besser Resultater ze kréien.
Schleifen Lysis Method:Et ass recommandéiert jonk Blieder ze benotzen.Huelt e klengt Stéck Blat (ongeféier 1 - 3 mm Duerchmiesser), setzt et an 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, a schleift et sou vill wéi méiglech (dëse Schrëtt kann gemaach ginn andeems Dir d'Blat mat engem 100 μl Pipettespëtz dréckt. fir d'Probe ze mëschen).Wann méi grouss Volumen vu Blatgewebe benotzt ginn (net méi wéi 7 mm), erhéicht de Volume vum Verdünnungsbuffer op 50 μl.Nodeems d'Blieder gemoolt sinn, sollt d'Léisung gréng sinn.No enger kuerzer Zentrifugéierung füügt 1 μl vum Supernatant an de PCR System als Reaktiounsschabloun.
Thermesch Lysis Method:Et ass recommandéiert jonk Blieder ze benotzen.Huelt e klengt Stéck Blat (ongeféier 1 - 3 mm Duerchmiesser), setzt se an 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, a waarmt et op 95 ° C fir 5 - 10 min.D'Lysiszäit ka passend verlängert ginn fir Blieder déi schwéier ze lyséieren (net méi wéi 20 min).Wann méi grouss Bänn vu Blatgewebe benotzt ginn (net méi wéi 7 mm), erhéicht de Volume vum Verdünnungsbuffer op 50 μl.No der Heizung, centrifugéiert kuerz, a füügt 1 μl Supernatant un de PCR System als Reaktiounsschabloun.
Probe Veraarbechtung- Planz Seed
Schleifen Lysis Method:Benotzt e Skalpell fir Somen mat engem Duerchmiesser vu 5 mm ze schneiden, addéiere se op 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, a schleift d'Probe mat engem Pipette Tipp oder aner Tools.Vortex kuerz a loosst 3-5 min bei Raumtemperatur stoen.Vergewëssert Iech datt d'Saatprobe am Verdünnungsbuffer ënnergeet ass.No enger kuerzer Zentrifugéierung füügt 1 μl vum Supernatant un de PCR System als Reaktiounsschabloun.
Thermesch Lysis Method:Benotzt e Skalpell fir Somen mat engem Duerchmiesser vu 5 mm ze schneiden, addéiere se op 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, a waarm bei 95 ° C fir 5 - 10 min.D'Lysiszäit ka passend verlängert ginn fir Blieder déi schwéier ze lyséieren (net méi wéi 30 min).No der Heizung, centrifugéiert kuerz, a füügt 1 μl Supernatant un de PCR System als Reaktiounsschabloun.
a.Scheren oder aner Tools kënnen och benotzt ginn fir Proben vu passenden Gréisst ze schneiden;Wann de Punch oder d'Schéier erëmbenotzt ginn, sollten se virun all Gebrauch mat 2% Natriumhypochlorit-Léisung gebotzt ginn fir Kräizkontaminatioun tëscht Proben ze vermeiden.
b.Vergewëssert Iech datt de Plant Direct Lysis Buffer komplett geschmollt ass virum Gebrauch.Wann de Puffer viskos ass oder Ausfäll huet, kann et op 37 ℃ erhëtzt ginn fir et komplett virum Gebrauch ze schmëlzen.
c.De Volume vun der Schabloun am Reaktiounssystem kann entspriechend ugepasst ginn no dem Differenz am Volume vum Planzmaterial a Verdünnungsmëttel hinzugefügt.
Planz Direkt Lysis Buffer
De Plant Direct Lysis Buffer A an dësem Produkt enthale gouf strikt optimiséiert fir de Genom vun de meeschte Planzegewebe ze befreien an ass gëeegent fir kuerzfristeg Lagerung vu rau Planzen bei 4 ℃.Wann d'Probe fir eng méi laang Zäit gespäichert muss ginn (zB 1 - 2 Méint), ass et recommandéiert de Supernatant an en neit EP-Röhre ze transferéieren an et bei -20 ℃ ze späicheren.Fir d'Proben méi stabil ze späicheren, füügt e gläiche Volumen vum Plant Direct Lysis Buffer B an den transferéierte Supernatant, mëscht gutt a späichert bei -20 ℃.Déi stabil Späicherzäit variéiert mat Planzenproben a Staaten.
Reaktioun System
| ddH2O | bis 20,0 µl | bis 50,0 µl |
| 2 × Plant Direct Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Planz Blat / rau Extrakt Probe(Kuckt op Probeveraarbechtung) | 0,5 – 3 mm Blatscheif/x µl | 0,5 – 3 mm Blatscheif/x µl |
a.Et enthält Mg2+bei enger final Konzentratioun vun 2 mM.
b.Et ass recommandéiert eng final Konzentratioun vun 0,4μM fir all Primer ze benotzen.Exzessiv Notzung vu Primer féiert zu enger verstäerkter net spezifescher Amplifikatioun.
c.D'Quantitéit u benotzte Probe kann no der aktueller Situatioun ugepasst ginn.De Betrag, deen an enger eenzeger Reaktioun vu rau lyséierter Probe benotzt gëtt, kann tëscht 2% - 20% vum Gesamtvolumen vun der Reaktioun ugepasst ginn.Wann Dir ze vill Proben benotzt, kann d'Verstäerkungsfehler verursaachen.
Reaktioun Programm
| Schrëtt | Temperatur | Zäit |
| Éischt Denaturatioun | 98 ℃ | 5 min |
| Denaturatioun | 95 ℃ | 10 sec |
| Annealing | 58 ~ 72 ℃ | 15 sec |
| Erweiderung | 72℃ | 30 sec |
| Finale Extensioun | 72℃ | 5 min |
a.Initial Denaturatioun (98 ℃, 5 min) fördert d'Lyse vu Planzgewebe, entlooss genomesch DNA déi fir PCR Amplifikatioun benotzt ka ginn.D'Zäit net verkierzen oder d'Temperatur erofsetzen.
b.Et ass recommandéiert et gläich mam Primer Tm Wäert ze setzen oder 2 ~ 4 ℃ méi héich wéi den Tm Wäert.Déi direkt Amplifikatioun DNA Polymerase, déi an dësem Produkt benotzt gëtt, ass anescht wéi konventionell Taq DNA Polymerase, an huet speziell Ufuerderunge fir d'Reaktioun annealing Temperatur; d'Benotzung vun héich annealing Temperatur kann effektiv nonspecific amplification reduzéieren an der amplification Effizienz verbesseren.Fir komplex Templates kann déi effizient Verstäerkung erreecht ginn andeems d'Annealtemperatur ugepasst gëtt an d'Verlängerungszäit verlängert.
c.Wann d'Längt vum Verstärkungsprodukt ≤1 kb ass, gëtt d'Verlängerungszäit op 30 sec/kb gesat;wann d'Längt vum Verstärkungsprodukt> 1 kb ass, gëtt d'Verlängerungszäit op 60 sec/kb gesat.
d.Fir komplex Echantillon oder Echantillon mat niddereg amplification nozeginn, kann d'Zuel vun Zyklen passend op 40 -50 Zyklen erhéicht ginn.
Uwendungen
Et ass applicabel fir direkt Verstäerkung vu Planzgewebe an High-Throughput-Screening vu Planzenproben déi keng Polysacchariden a Polyphenole enthalen.
Notizen
Nëmme fir Fuerschung benotzt.Net fir Diagnostice Prozeduren ze benotzen.
1. Fir rau Planzeamplifikatioun oder direkt Amplifikatioun ass et recommandéiert fir gereinegt genomesch DNA als positiv Kontroll ze benotzen ier Dir d'Experiment ufänkt fir sécherzestellen datt de System, d'Primeren an d'Operatiounen korrekt sinn.
2. Déi direkt Amplifikatioun DNA Polymerase, déi an dësem Kit benotzt gëtt, huet staark Korrekturaktivitéit.Wann TA Klonen muss gemaach ginn, ass et recommandéiert d'DNA ze purifizéieren ier Dir den Adenin bäidréit.
3. Primer Design Guide:
a.Et ass recommandéiert datt déi lescht Basis um 3′ Enn vum Primer G oder C ass.
b.Konsekutiv Mëssverständis sollten an de leschten 8 Basen um 3′ Enn vum Primer vermeit ginn.c.Vermeiden Haarnadelstrukturen am 3′ Enn vum Primer.
d.D'Ënnerscheeder am Tm Wäert vum Forward Primer an de Reverse Primer sollten net méi wéi 1 ℃ sinn an den Tm Wäert soll op 60 ~ 72 ℃ ugepasst ginn (Primer Premier 5 ass recommandéiert fir den Tm Wäert ze berechnen).
e.Extra zousätzlech Primer Sequenzen déi net mat der Schabloun passend sinn, sollten net abegraff ginn wann de Primer Tm Wäert berechnen.
f.Et ass recommandéiert datt de GC Inhalt vum Primer 40% -60% ass.
g.D'Gesamtverdeelung vun A, G, C an T am Primer soll esou gläich wéi méiglech sinn.Vermeiden Benotzung vun Regiounen mat héijen GC oder AT Inhalter.
h.Vermeit d'Präsenz vu komplementäre Sequenzen vu 5 oder méi Basen entweder am Primer oder tëscht zwee Primer a vermeit d'Präsenz vu komplementäre Sequenzen vun 3 oder méi Basen um 3' Enn vun zwee Primer.
ech.Benotzt d'NCBI BLAST Funktioun fir d'Spezifizitéit vum Primer ze kontrolléieren fir net spezifesch Amplifikatioun ze vermeiden.
