Proteinase K NGS (Pudder)
Cat No: HC4507A
NGS Protease K ass e stabile Serinprotease mat héijer Enzymaktivitéit a breet Substratspezifizitéit. D'Enzym zerstéiert preferentiell Esterbindungen a Peptidbindungen niewent dem C-Terminal vun hydrophobe Aminosäuren, Schwefelhaltege Aminosaieren an aromatesche Aminosaieren.Also, et gëtt dacks benotzt fir Proteinen a kuerz Peptiden ze degradéieren.NGS Protease K ass eng typesch Serinprotease mat der Asp39- Sengem69-Ser224katalytesch Triad déi eenzegaarteg ass fir Serinproteasen, an de katalytesche Zentrum ass ëmgi vu Seel Ca2+Bindungsplaze fir Stabiliséierung, déi héich Enzymaktivitéit ënner enger méi breet Palette vu Bedéngungen behalen.
Spezifizéierung
| Ausgesinn | Wäiss bis off-wäiss amorph Pudder, lyophiliséiert |
| Spezifesch Aktivitéit | ≥40U/mg fest |
| DNase | Keen fonnt |
| RNase | Keen fonnt |
| Biobelaaschtung | ≤50CFU/g fest |
| Nukleinsäurereschter | <5pg/mg fest |
Eegeschaften
| Quell | Tritirachium album |
| EC Nummer | 3.4.21.64(Rekombinant vum Tritirachium Album) |
| Molekulare Gewiicht | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelektresche Punkt | 7.81 Fig.1 |
| Optimal pH | 7.0-12.0 (All Leeschtung héich Aktivitéit) Fig.2 |
| Optimal Temperatur | 65℃ Fig.3 |
| pH Stabilitéit | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Thermesch Stabilitéit | Ënner 50 ℃ (pH 8.0, 30min) Fig.5 |
| Stockage Stabilitéit | Gelagert bei 25 ℃ fir 12 Méint Fig.6 |
| Aktivatoren | SDS, urea |
| Inhibitoren | Diisopropylfluorophosphat;benzylsulfonylfluorid |
Stockage Konditiounen
Späichert de lyophiliséierte Pulver bei -25 ~ -15 ℃ fir eng laang Zäit ewech vum Liicht;No der Opléisung, aliquot an entspriechend Volumen fir kuerzfristeg Lagerung bei 2-8 ℃ ewech vu Liicht oder laangfristeg Lagerung bei -25 ~ -15 ℃ ewech vum Liicht.
Virsiichtsmoosnamen
Drot Schutzhandschuesch a Brëll beim Gebrauch oder Gewiicht, a gutt gelëfter nom Gebrauch.Dëst Produkt kann allergescher Reaktiounen op der Haut a eeschte Auge Reizung verursaachen.Wann inhaléiert, kann et Allergie oder Asthma Symptomer oder Dyspnoe verursaachen.Kann Atmungsirritatioun verursaachen.
Eenheet Definitioun
Eng Eenheet vun NGS Protease K ass definéiert wéi d'Quantitéit un Enzym erfuerderlech ass fir Kasein an 1 μmol L-Tyrosin ënner Standardbestëmmungsbedéngungen ze hydrolyséieren.
Reagens Virbereedung
| Reagens | Fabrikant beschwéiert | Katalog |
| Kasein techneschvun Rëndfleesch Mëllech | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemeschReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemeschReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemeschReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trichloracetic sauerem | Sinopharm ChemeschReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natriumacetat | Sinopharm ChemeschReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Essigsäure | Sinopharm ChemeschReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemeschReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natriumkarbonat | Sinopharm ChemeschReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-phenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosin | Sigma | 9 3829 |
Reagens I:
Substrat: 1% Kasein aus Rëndfleeschléisung: 1g Rëndfleeschkasein opléisen an 50ml 0,1M Natriumphosphatléisung, pH 8,0, Hëtzt am Waasserbad bei 65-70 °C fir 15 Minutten, réieren an opléisen, mat Waasser ofkillen, ugepasst duerch Natriumhydroxid op pH 8,0 a verdënntem op 100ml.
Reagens II:
TCA Léisung: 0,1M Trichloracetic Seier, 0,2M Natriumacetat an 0,3M Essigsäure (gewien 1,64g Trichloracetic Seier + 1,64g Natriumacetat + 1,724mL Essigsäure successiv, addéiere 50mL deioniséiertem Waasser, ajustéiert mat HCl03 op 4. 100 ml).
Reagens III:
0,4 m Natriumkarbonat Léisung (gewien 4,24 g Waasserfräi Natriumkarbonat an opléisen an 100 ml Waasser)
Reagens IV:
Folin Phenol Reagens: 5 Mol mat deioniséiertem Waasser verdünnen.
Reagens V:
Enzymverdünnung: 0,1 M Natriumphosphatléisung, pH 8,0.
Reagens VI:
L-Tyrosin Standard Léisung: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol / ml L-tyrosine opgeléist mat 0,2M HCl.
Prozedur
1. Maacht den UV-Vis Spektrofotometer un a wielt photometresch Messung.
2. Setzt d'Wellenlängt als 660nm.
3. Maacht d'Waasserbad un, setzt d'Temperatur op 37 ℃, suergt fir d'Temperatur onverännert fir 3-5mins.
4. Preheat 0,5mL Substrat an engem 2mL Zentrifuge Röhre bei 37℃ Waasserbad fir 10mins.
5. Extrait 0,5mL verdënntem Enzymléisung an de virgehëtzten Zentrifugeröhre fir 10 Minutten.Setzt Enzymverdünnung als eidel Grupp.
6. Fügt 1,0 mL TCA Reagens direkt no der Reaktioun.Mix gutt an inkubéiert am Waasserbad fir 30 Minutten.
7. Centrifugate Reaktioun Léisung.
8. Füügt déi folgend Komponenten an der spezifizéierter Uerdnung.
| Reagens | Volumen |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4M Natriumkarbonat | 2,5 ml |
| Folin phenol reagens | 0,5 ml |
9. Mix gutt virum Inkubatioun am Waasserbad bei 37 ℃ fir 30 Minutten.
10. OD660gouf als OD bestëmmt1;eidel Kontrollgruppe: Enzymverdünnung gëtt benotzt fir Enzymléisung ze ersetzen fir OD ze bestëmmen660wéi OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-Tyrosin Standardkurve: 0.5ml verschidde Konzentratioun L-Tyrosin Léisung, 2.5ml 0.4M Natriumkarbonat, 0.5ml Folin Phenol Reagens an 5ml Zentrifuge Röhre, inkubéieren an 37 ℃ fir 30mins, entdecken fir OD660fir eng aner Konzentratioun vu L-Tyrosin, kritt dann d'Standardkurve Y = kX + b, wou Y d'L-Tyrosin Konzentratioun ass, X ass OD600.
Berechnung
2: Gesamtvolumen vun der Reaktiounsléisung (ml)
0,5: Volume vun Enzym Léisung (ml)
0.5: Reaktiounsflëssegkeetsvolumen benotzt bei der chromogener Bestëmmung (ml)
10: Reaktiounszäit (min)
Df: Verdünnung multiple
C: Enzymkonzentratioun (mg/ml)
Figuren
Fig.1 DNA Rescht
| Prouf | Ave C4 | Nukleinsäure Erhuelung (pg/mg) | Erhuelung (%) | Total Nukleic Säure ( pg/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | - | - |
| STD 1 | 12.955 |
- |
- |
- |
| STD 2 | 16 | |||
| STD 3 | 19.125 | |||
| STD 4 | 23.135 | |||
| STD 5 | 26.625 | |||
| RNA-Free H2O | Onbestëmmt | - | - | - |
Fig.2 Optimal pH
Fig.3 Optimal Temperatur
Fig.4 pH Stabilitéit
Fig.5 thermesch Stabilitéit
Fig.6 Stockage Stabilitéit bei 25 ℃
