Temperaturempfindlech UNG
Temperaturempfindlech UNG (TS-UNG) gëtt duerch rekombinant Ausdrock an E. coli kritt.Den Enzym katalyséiert d'Verëffentlechung vu fräiem Uracil aus uracil-enthaltende eenzeg- an duebelstrengeg DNA an ass inaktiv géint RNA.Am Verglach mam konventionellen UNG Enzym vun E. coli Gen Hierkonft, huet TS-UNG Enzym méi héich Aktivitéit bei niddregen Temperaturen (20 ℃ ~ 37 ℃) an ass Temperaturempfindlech a liicht inaktivéiert (50 ℃), vermeit d'Degradatioun vun der dUTP-enthaltend Amplifikatioun Produkter bei Raumtemperatur duerch d'Reschtaktivitéit, déi no der Inaktivéierung vum konventionellen UNG-Enzym bleift.Dofir ass TS-UNG Enzym net nëmme gëeegent fir PCR Kontaminatioun Präventiounsreaktioun, awer passt och gutt mam RT-PCR Amplifikatiounsprogramm a kann an der RT-PCR Kontaminatioun Präventiounsreaktioun benotzt ginn.
Recommandéiert Applikatioun
Kontaminatioun Präventioun Amplifikatioun
Stockage Zoustand
-20°C fir laangfristeg Lagerung, sollt virum Gebrauch gutt gemëscht ginn, evitéiert heefeg Afréiere-Thaw.
Stockage Puffer
20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilisator, 50% Glycerol.
Eenheet Definitioun
D'Quantitéit un Enzym erfuerderlech fir 1 µg eenzegstrengeg DNA mat dU Basen an 1 Stonn bei 37 ° C ze degradéieren ass 1 Eenheet vun Aktivitéit (U).
Qualitéitskontroll
1.SDS-PAGE elektrophoretesch Rengheet méi wéi 98%
2.Degradatioun Aktivitéit, Batch-zu-Batch Kontroll, Stabilitéit
3.Keng exogen Nuklease Aktivitéit, keng exogen Endonuklease oder Exonuklease Kontaminatioun.
Uweisungen
| Komponenten | Volumen (μL) | Finale Konzentratioun |
| 10 × PCR Buffer (dNTP fräi, Mg²+fräi) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (dTTP ersetzen) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 1 U/μLTS-UNG | 0,5 (0,1-0,5) | 0,5 U (0,1-0,5 U) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Schabloun | - | ＜1μg/Reaktioun |
| ddH₂O | Zu 50 | - |
Bemierkung: a: Wann fir qPCR / qRT-PCR benotzt gëtt, soll d'fluoreszent Sonde an de Reaktiounssystem bäigefüügt ginn.Normalerweis kann eng final Primer Konzentratioun vun 0,2 μM gutt Resultater ginn;Wann d'Reaktiounsleistung schlecht ass, kann d'Primerkonzentratioun am Beräich vun 0,2-1 μM ugepasst ginn.Normalerweis gëtt d'Sondkonzentratioun am Beräich vun 0,1-0,3 μM optimiséiert.Konzentratiounsgradientexperimenter kënne gemaach ginn fir déi bescht Kombinatioun vu Primer a Sonde ze fannen.
Notizen
1.Déi optimal Reaktiounstemperatur vum TS-UNG Enzym ass relativ niddereg, an et kann am Beräich vun 20 ℃ ~ 37 ℃ optimiséiert ginn, d'Dosis vum Enzym an d'Reaktiounszäit kann am Beräich vun 0.1 ~ 0.5 U, 5 ~ optimiséiert ginn. 10 min;an den Enzym kann am Prozess vun der ëmgedréiter Transkriptioun inaktivéiert ginn.
2.Et ass gëeegent fir PCR an RT-PCR fir Kontaminatioun ze vermeiden.
3.Vermeiden heefeg Afréiere-Thaw, a setzt net op grouss Temperaturschwankungen aus.
4.Verschidde Genen, déi amplifizéiert ginn, hunn ënnerschiddlech Benotzungseffizienz vun dUTP a Empfindlechkeet fir UNG Enzym, dofir, wann d'Benotzung vum UNG System zu enger Ofsenkung vun der Detektiounsempfindlechkeet féiert, sollt de Reaktiounssystem ugepasst an optimiséiert ginn, wann Dir technesch Ënnerstëtzung braucht, kontaktéiert w.e.g. eis Firma.
