Proteinase K mNGS (flësseg)
Proteinase K ass eng stabil Serin Protease mat breet Substrat Spezifizitéit.Et degradéiert vill Proteinen am gebiertege Staat och a Präsenz vu Wäschmëttelen.Beweiser aus Kristall- a molekulare Strukturstudien weisen datt den Enzym zu der Subtilisinfamill gehéiert mat enger aktiver Site katalytescher Triad (Asp)39- Sengem69-Ser224).Déi predominant Plaz vun der Spaltung ass d'Peptidbindung nieft der Carboxylgrupp vun alifateschen an aromatesche Aminosäuren mat blockéierte Alpha Aminogruppen.Et gëtt allgemeng fir seng breet Spezifizitéit benotzt.Dës Proteinase K ass speziell fir mNGS entworf.Am Verglach mat der anerer Proteinase K enthält et nach manner Nukleinsäurekontaminatioun mat der selwechter enzymatescher Leeschtung, wat d'Downstream mNGS Uwendung besser ka garantéieren.
Stockage Konditiounen
2-8 ℃ fir 2 Joer
Spezifizéierung
| Ausgesinn | Faarflos bis hellbraune Flëssegkeet |
| Aktivitéit | ≥800 U/ml |
| Protein Konzentratioun | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Keen fonnt |
| DNase | Keen fonnt |
| RNase | Keen fonnt |
Eegeschaften
| EC Nummer | 3.4.21.64(Rekombinant vum Tritirachium Album) |
| Isoelektresche Punkt | 7.81 |
| Optimal pH | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| Optimal Temperatur | 65 ℃ Fig. 2 |
| pH Stabilitéit | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Thermesch Stabilitéit | Ënner 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| Stockage Stabilitéit | Iwwer 90% Aktivitéit fir 12 Méint bei 25 ℃ |
| Aktivatoren | SDS, urea |
| Inhibitoren | Diisopropylfluorophosphat;Phenylmethylsulfonylfluorid |
Uwendungen
1. Genetesch Diagnostice Kit
2. RNA an DNA Extraktioun Kits
3. Extraktioun vun net-Protein Komponenten aus Stoffer, Degradatioun vun Protein Gëftstoffer, wéi DNAImpfungen an Virbereedung vun Heparin
4. Virbereedung vu Chromosomen DNA duerch pulséiert Elektrophorese
5. Western blot
6. Enzymatesch glycosyléiert Albuminreagenz in vitro Diagnostik
Virsiichtsmoosnamen
Drot Schutzhandschuesch a Brëll beim Gebrauch oder Gewiicht, a gutt gelëfter nom Gebrauch.Dëst Produkt kann allergescher Reaktiounen op der Haut a eeschte Auge Reizung verursaachen.Wann inhaléiert, kann et Allergie oder Asthma Symptomer oder Dyspnoe verursaachen.Kann Atmungsirritatioun verursaachen.
Eenheet Definitioun
Eng Eenheet (U) ass definéiert wéi d'Quantitéit un Enzym erfuerderlech ass fir Kasein ze hydrolyséieren fir 1 μmol ze produzéierenTyrosin pro Minutt ënner de folgende Konditiounen.
Reagens Virbereedung
Reagens I: 1g Mëllechkasein gouf an 50ml vun 0.1M Natriumphosphatléisung (pH 8.0) opgeléist, 15mins an 65-70 ℃ Waasser inkubéiert, gerührt an opgeléist, mat Waasser ofgekillt, duerch Natriumhydroxid op pH 8.0 ugepasst, a fixe Volumen 100 ml.
Reagens II: 0,1M Trichloracetic Seier, 0,2M Natriumacetat, 0,3M Essigsäure.
Reagens III: 0,4M Na2CO3Léisung.
Reagens IV: Forint Reagens verdünnt mat purem Waasser fir 5 Mol.
Reagens V: Enzymverdünnung: 0,1M Natriumphosphatléisung (pH 8,0).
Reagens VI: Tyrosinléisung: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml Tyrosin opgeléist mat 0,2M HCl.
Prozedur
1. 0,5 ml Reagens I gëtt virgewiermt op 37 ℃, füügt 0,5 ml Enzymléisung derbäi, gutt vermëschen, an inkubéiert bei37 ℃ fir 10 Minutten.
2. Füügt 1ml Reagens II fir d'Reaktioun ze stoppen, gutt mëschen a weider Inkubatioun fir 30mins weider.
3. Zentrifugate Reaktioun Léisung.
4. Huelt 0.5ml Supernatant, füügt 2.5ml Reagens III, 0.5ml Reagens IV derbäi, gutt mëschen a bei 37 ℃ inkubéierenfir 30 min.
5. OD660gouf als OD bestëmmt1;eidel Kontroll Grupp: 0,5ml reagent V gëtt benotzt Enzym ze ersetzenLéisung fir OD ze bestëmmen660wéi OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-Tyrosin Standardkurve: 0,5mL verschidde Konzentratioun L-Tyrosin Léisung, 2,5mL Reagens III, 0,5mL Reagens IV an 5mL Zentrifugerröhr, inkubéiert an 37 ℃ fir 30mins, entdecken fir OD660fir verschidden Konzentratioune vu L-Tyrosin, kritt dann d'Standardkurve Y=kX+b, wou Y d'L-Tyrosinkonzentratioun ass, X ass OD600.
Berechnung
2: Gesamtvolumen vun der Reaktiounsléisung (ml)
0,5: Volume vun Enzym Léisung (ml)
0.5: Reaktiounsflëssegkeetsvolumen benotzt bei der chromogener Bestëmmung (ml)
10: Reaktiounszäit (min)
Df: Verdünnung multiple
C: Enzymkonzentratioun (mg/ml)
Referenzen
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56:103-108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Editioun, Cold Spring HarborLaboratoire Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figuren
Fig.1 Optimal pH
100mM Puffer Léisung: pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH 9.0-12.5, Glycin-NaOH. Enzym Konzentratioun: 1mg/ml
Fig.2 Optimal Temperatur
Reaktioun am 20 mM K-Phosphatbuffer pH 8,0.Enzym Konzentratioun: 1 mg/ml
Fig.3 pH Stabilitéit
25 ℃, 16 h-Behandlung mat 50 mM Pufferléisung: pH 4,5- 5,5, Acetat;pH 6,0-8,0, Na-Phosphat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycin-NaOH.Enzym Konzentratioun: 1 mg/ml
Fig.4 thermesch Stabilitéit
30 min-Behandlung mat 50 mM Tris-HCl Puffer, pH 8,0.Enzym Konzentratioun: 1 mg/ml
Fig.5 Stockage stabilty at 25 ℃
