Hotstart Taq DNA Polymerase
Hot Start Taq DNA Polymerase (Antibody Modification) ass eng waarmstart thermostabil DNA Polymerase vum Thermus aquaticus YT-1, deen eng 5′→3′ Polymerase Aktivitéit an eng 5′ flap Endonuclease Aktivitéit huet.Den Hot-Start Taq DNA Polymerase ass eng Taq DNA Polymerase déi duerch thermolabile Taq Antikörper geännert gëtt.Antikörpermodifikatioun huet d'Spezifizitéit, d'Sensibilitéit an d'Ausbezuele vu PCR erhéicht.
Komponenten
| Komponent | HC1012 A-01 | HC1012 A-02 | HC1012 A-03 | HC1012 A-04 |
| 5 × HC Taq Buffer | 4x1 ml | 4 × 10 ml | 4 × 50 ml | 5 × 400 ml |
| Hot Start Taq DNA Polymerase (Antikörper modifizéiert) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 mll | 5ml vun | 10 × 5 ml |
Uwendungen
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 bei 25 ℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 an 50% Glycerol.
Stockage Zoustand
Transport ënner 0 ° C a bei -25 ° C ~ -15 ° C gelagert ginn.
Eenheet Definitioun
Eng Eenheet ass definéiert wéi d'Quantitéit un Enzym deen 15 nmol dNTP an sauer onopléisbar Material an 30 Minutte bei 75 ° C integréiert.
Qualitéitskontroll
1.Endonuclease Aktivitéit:Inkubatioun vun 20 U Enzym mat 4 μg pUC19 DNA fir 4 Stonnen bei 37 ℃ huet zu keng detektéierbaren Degradatioun vun der DNA gefouert wéi duerch Gelelektrophorese bestëmmt.
2.5 kb Lambda PCR:25 Zyklen vun der PCR Amplifikatioun vu 5 ng Lambda DNA mat 1,25 Eenheeten vun Taq DNA Polymerase an der Präsenz vun 200 µM dNTPs an 0,2 µM Primer Resultater am erwaarten 5 kb Produkt.
3.Exonuclease Aktivitéit:Inkubatioun vun enger 50 µl Reaktioun mat engem Minimum vun 12,5 U vun Taq DNA Polymerase mat 10 nmol 5'-FAM Oligonukleotid fir 30 Minutten bei 37 ℃ bréngt keng detektéierbar Degradatioun.
4.RNase Aktivitéit:Inkubatioun vun 10 μL Reaktioun mat 20 U Enzym mat 1μg vun RNA Transkriptiounen fir 2 Stonnen bei 37 ° C huet zu keng detektéierbaren Degradatioun vun der RNA gefouert wéi duerch Gelelektrophorese bestëmmt.
5.Hëtzt Inaktivéierung:Nee.
Reaktioun System
| Komponenten | Volumen |
| Schabloun DNAa | fakultativ |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| dNTP Mix (10 mM jeweils) | 0,5 μL |
| 5 × HC Taq Buffer | 5 μl |
| Taq DNA Polymeraseb(5U/μL) | 0,125 μL |
| Nuklease-gratis Waasser | Bis zu 25 μL |
Notizen:
1) a.
| DNA | Betrag |
| Genomesch | 1 ng-1 μg |
| Plasmid oder Viral | 1 pg-1 ng |
2) b.Déi optimal Konzentratioun vun Taq DNA Polymerase ka vu 5-50 Eenheeten / ml (0,1-0,5 Eenheeten / 25 µL Reaktioun) a spezialiséierten Uwendungen variéieren.
Thermal Cycling Protokoll
PCR
| Schrëtt | Temperatur(°C) | Zäit | Cyclen |
| Éischt Denaturatiouna | 95 ℃ | 1-3 Minutten | - |
| Denaturatioun | 95 ℃ | 15-30 Uhr | 30-35 Zyklen |
| Annealingb | 45-68 ℃ | 15-60 Uhr | |
| Erweiderung | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Finale Extensioun | 68 ℃ | 5 min | - |
Notizen:
1) Eng initial Denaturatioun vun 1 min bei 95 ° C ass genuch fir déi meescht Amplifikatiounen.Fir schwiereg Schabloune gëtt eng méi laang Denaturatioun vun 2-3mins bei 95°C recommandéiert.Mat Kolonie PCR ass eng initial 5mins Denaturatioun bei 95 ° C recommandéiert.
2) Den Glühungsschrëtt ass typesch 15-60 s.Annealing Temperatur baséiert op den Tm vum Primer Pair an ass typesch 45-68 ℃.
